Analyse du liquide céphalo-rachidien dans les leucémies aigues

Analyse du liquide céphalo-rachidien
dans les leucémies aiguës
S. GIRARD
Service d’Hématologie Biologique
Centre de Biologie et d’Anatomie Pathologie Sud
Hôpital LYON SUD
Siemens, 21 juin 2012, Paris
Rappels physiologiques
3ème milieu intérieur de l’organisme
Volume total :
→ 140 mL +/- 30 mL chez l’adulte
→ 100 mL chez enfant de 10 ans
→ 50 mL chez nourrisson
Répartition en 2 compartiments :
→ Central (15% du volume) :
• 2 ventricules latéraux,
• 3ème et 4ème ventricule
• aqueduc de Sylvius
• canal épendymaire
→ Périphérique (85% du volume) :
• espaces méningés sous-arachnoïdien
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Production :
→ Mécanismes de filtration du plasma et sécrétion active
→ À 80% par les plexus choroïdes (paroi des 4 ventricules cérébraux ).
→ À 20% par l’épendyme ventriculaire et les vaisseaux sanguins des espaces
sous-arachnoïdiens
→ Permanente : volume de 450 mL/24H
→ Résorption / granulations de Pacchioni
3 renouvellements quotidiens (25% en 1H)
Interface SNC/LCR/sang
– sang/LCR Barrière
hémato-méningée
(plexus
choroides,
arachnoidiennes)
– LCR/SNC Barrière méningo-encéphalique (épendyme,pie-mère…)
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villosités
Composition cellulaire normale
GR et GB : < 2 /µL
Cellularité faible
Leucocytes par passage leptoméningé :
→ Cellules lymphocytaires (+/- activées)
→ Monocytes / Macrophages
→ Exceptionnels polynucléaires neutrophiles
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Cellules du revêtement cavitaire
→ cellules méningothéliales (= cellules thécales)
→ cellules des plexus choroïdes et épendymaires
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Composition cellulaire anormale
Contamination sanguine : hématies, leucocytes , cellules pathologiques …
Contamination ostéo-médullaire
Cellules cartilagineuses
Cellules épidermiques, malpighiennes
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LCR et hémopathie aiguë
Dissémination probable / embole hématogène en phase initiale / évolution
Pas de problème diagnostique
Hypercellularité
(GB > 30/mm3 jusqu’à 1000 à 1500/mm3)
Infiltration blastique franche
Aspect monomorphe avec nappes régulières de blastes
Identification des blastes / infiltration du sang périphérique et/ou de la lésion médullaire
LAL
LCR
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SANG
MO
LAL
lymphocyte
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LAM (M0 FAB)
LAM (M5 FAB)
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Diagnostic plus difficile …
Faible cellularité (Ex : GB < 2/µL et 1 cellule d’aspect blastique)
Blastes difficilement identifiables
→ Conservation dans le liquide méningé hypoprotéique = cellules fragilisées
→ Centrifugation qui modifie la morphologie : étranglements nucléaires =
cellule en « trêfle »
→ Blastes de LAL de morphologie proche des lymphocytes
→ Injections IT MTX = morphologie modifiée ( taille augmentée, irrégularités
nucléaires et lyse cellulaire)
LCR hémorragique + présence de blastes
→ Origine sanguine ou méningée ?
→ Contrôle à réaliser
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LAL et atteinte méningée
Enfant
– Diagnostic : 3 à 5% (Mahmoud HH. et al., NEJM 1993)
– Rechute : 6 à 14% des cas (Reiter A. et al., Blood 1994 ; PUI CH. et al., Lancet Oncol 2008)
Rq : moins de 2% dans certains protocoles car intensification IT // diminution
progressive puis disparition de l’irradiation intracranienne (PUI CH. et al., Blood
2010)
Adulte
– Diagnostic : 5 à 10%
(Fiere D. et al., JCO 1993 ; Lazarus HM. et al., Blood 2006)
– Rechute : 1 et 15% selon les études (Kantarjian HM. et al., Blood 1998)
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LAM et atteinte méningée
Enfant
– Diagnostic : 10% environ / entre 6 et 29% selon les études (Johnston DL. et
al., PBC 2010 ; Webb DH. et al., Blood 2011)
• Intérêt démontré des IT prophylactiques (Webb DH. et al., Blood 2001)
• Survie globale identique , atteinte méningée ou non , mais risque de
rechute méningé isolée supérieure si infiltration initiale (Johnston DL. et
al., PBC 2010)
Adulte
– Au diagnostic : < 5% (Bommer M. et al., Haematologica 2010 ; Döhner H. et al., Blood
2010 ; Rees JK. et al., Lancet 1986)
• Evolution vers disparition de l’analyse du LCR en routine.
• Pas d’indication de prophylaxie IT si pas de symptôme clinique sauf si
hyperleucocytose (Döhner H. et al., Blood 2010 ; Rees JK. et al., Lancet 1996 ;
Morrison et al., Leukemia 1992)
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LA et CNS risk classification
Nécessité d’établir une classification pour traiter les patients en fonction du statut de
leur atteinte = Ne pas surtraiter ou sous traiter les patients.
1985 - Rome Leukemia Workshop
(Mastrangelo R. et al., Med. Pediatr. Oncol. 1986)
CNS disease = CSF leukocyte count of > 5 / µL and lymphoblasts on cytologic examination
1993 - National Cancer Institute Workshop
(Mahmoud HH. et al., NEJM 1993)
Révision de la définition : taux élevé de rechute méningée avec initialement GB < 5/µl
CNS-1 : no detectable blast cells
CNS-2 : WBC < 5/µL and detectable blast cells
CNS-3 : WBC ≥ 5/µL and blast cells or cranial-nerve palsies
1998- Prise en compte des ponctions traumatiques
(PUI CH. et al., Blood 1998)
Contaminated : > 10 erc / µL and blast cells +
2003 – Evolution
(Bürger B. et al, Blood )
TLP = Traumatic Lumbar Puncture
TLP - :≥10 erc / µL and no blasts
TLP+ : ≥ 10 erc / µL and blast cells
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Tableau récapitulatif de la classification du
risque méningé
Statut
GR
GB
Présence de blastes
sur la cytospin
CNS-1
< 10/µL
< 5/µL
Absence
CNS-2
< 10/µL
< 5/µL
Présence
< 10/µL
≥ 5/µL
Présence
CNS-3
Masse cérébrale, paralysie des nerfs craniens
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TLP -
≥ 10/µL
Absence
TLP+
≥ 10/µL
Présence
CNSCNS-1
CNSCNS-2
CNSCNS-3
TLP+
TLPTLP-
Nbre de patients
Mahmoud et al., NEJM 1993
Study XI SJCH
83
12
5
/
/
351
De Moerloose at al., Blood 2010
EORTC-CLG Study 58951
88,6
9,4
2
/
/
411
61,2
25,5 vs 45
en CMF
3,6
9,7
/
165
72,6
13,4
3,9
10
/
358
66,5
18,1
5,3
10,1
/
188
58,7
31,6
2,8
6,9
/
247
72,1
20,5
1,8
5,6
/
498
Pui, Blood 1998
Study XIIIA SJCH
Pui et al., leukemia 2010
Study 11 SJCH
Study 12 SJCH
Study 13B SJCH
PUI et al., NEJM 2009
Study 15 SJCH
India - Advani et al., Ann Oncol 1999
Sirvent et al., Eur J Cancer 2011
EORTC-CLG Study 58881
Bürger et al., JCO 2003
(ALL-BFM 1995)
te Loo et al., JCO 2006
(ALL-7, ALL-8)
1,3
92,1
2,5
2,4
3
/
2025
79,8
6080%
58
5,1
2,9
6,7
5,5
2012
5-20%
21
2-3%
2
10%
12
6%
7
304
0,8
700
5,7
174
India - Marwaha et al., Leuk Lymph
2010
UKALL X modifié
Zwaan et al., 2004 Blood
AML 87, AML 94 et AML 97
CMF : Bromberg et al., Neurol. 2007
S. GIRARD - 21.06.2012
4,14
52,3
21,3
7,5
13,2
73 CMF versus 32 morpho
1054
CNS-2 (GB < 5/µl et blastes +)
Quelque soit le nombre de GB dans le LCR si présence de blastes :
augmentation du risque de rechute méningée
(Mahmoud HH. et al., NEJM 1993 , Smith M. et al., JCO 1996, Sirvent N. et al., Eur J Cancer 2011)
Mauvais pronostic mais en lien avec le traitement (schémas IT, irradiation ou non)
(Lauer et al., Proc Am Soc Clin Oncol 1994 ; PUI CH., JCO 2003; Gilchrist GS. et al., JCO 1994)
Sans prophylaxie précoce au niveau méningée :
3,2 fois plus de rechute à localisation méningée / CNS-1
(Mahmoud HH. et al., NEJM 1993)
ALL-BFM-95 Study :
Avec prophylaxie précoce :
pas de différence entre CNS-1 et CNS-2
(Bürger B.et al., 2003 JCO)
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TLP = Traumatic Lumbar Puncture (GR ≥ 10/µL )
Introduction iatrogène de blastes circulants dans le sang périphérique
TLP- : Pas de mauvais pronostic évident. Prise en compte comme des CNS-1.
TLP + : Taux de rechute important dans les LAL mais pas dans les LAM.
(Te Loo DM. et al., JCO 2006; Gajjar A. et al., Blood 2000 et Zwaan et al., Blood 2004)
Pronostic intermédiaire entre CNS-1 et CNS-3
(Bürger B. et al., JCO 2003)
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Méthode d’analyse
Délai prélèvement/prise en charge technique :
→ A température ambiante, délai < 2H
→ A +4°C, délai maxi 24H
60 min = lyse cellulaire GB et GR
2 H = disparition de 50% des PNNE
3 H =disparition monocytes et lymphocytes respectivement
de 35% et 30%
(Steele R.W. et al., JCM 1986; Deisenhammer f. et al., Eur Handbook of
neurological management 2008; Eur J Neurol 2006)
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Aspect macroscopique
Numération cellulaire
→ Hématimètre (Nageotte / Malassez)
→ GR et GB /mm3 ou /µL
Cytocentrifugation directe
Volume ? Temps ? Durée ?
Rendement cellulaire…
Recommandations SHANDON
Volume standard à cytocentrifuger = 5 gouttes soit 250 µl
Dilution sérum physiologique si hypercellulaire ou hémorragique
Réalisation du compte GB et GR (hématimètre) :
–
–
–
–
–
–
Si GB > 500/µL (entre 500 et 1000/µL) = dilution ½
Si GB entre 1001 et 1500/µL = dilution au 1/3
Si GB entre 1501 et 2000/µL = dilution au ¼
Si GB entre 2001 et 2500/µL = dilution au 1/5
Si GB entre 2501 et 3000/µL = dilution au 1/6
Si GR > 5000/µL alors diluer pour obtenir maxi un taux de 5000/µL
Addition de 1 goutte (50 µL) de Sérum Albumine à 30%
Vitesse et temps : 700 rpm/5 min
Vitesse diminuée entre 500 et 800 rpm pour cellules fragiles
Operators manual for Cytospin3 SHANDON « Use of the Cytospin for Hematology and other Clinical Microscopy Specimens »
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Données bibliographiques
Références
Volume de LCR
Addition de sérum
Vitesse de
centrifugation
Temps de
centrifugation
SHANDON
5 drops (250 µL)
1 goutte (50 µL) SA 30%
700 tours/min
5 minutes
Evans D.I.K et al.,
JCP 1974
9 drops (600 µL)
9 drops (600µL) sérum AB
1000 tours
Moins de 1 mL :
400 à 800 tours/min
SFCC mai 1994
?
Pui C.H. et al.,
Blood 1998
(SJCH)
1,0 mL
(<500GB/mm3 sinon
dilution dans solution saline)
Mahmoud H.H. et
al., 1993 NEJM
SJCH
0,5 à 1,5 mL
Bommer M. et al.,
Haematologica
2010
200 µL
Odom L.F.et al.,
Cancer 1990
200 à 500 µL
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1 goutte sérum
1 goutte SA 22%
Plus de 1 mL:
800 tours/min
(centrifugation)
400 à 800 tours/min
(cytocentrifugation)
10 minutes
20 minutes
10 minutes
20 minutes
1000 tours/ min
5 minutes
1000 tours/min
5 minutes
/
1500 tours/min
5 minutes
2 gouttes SA 22%
1200 tours/min
5 minutes
1 goutte SA 22%
Analyse cytologique
Coloration de choix : MGG
Examen microscopique optique :
–
–
–
–
–
X 10 : Appréciation qualité de l’étalement
richesse cellulaire
proportion de GR
mono ou polymorphisme
amas cellulaires
cellules de grande taille
X 100 : Analyse précise des types cellulaires
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Amélioration du rendement cellulaire
15 à 30 % de perte cellulaire entre la cytospin et la lame…: buvard, évaporation, ….
(Dayan et Stokes, Lancet 1973)
Addition de sérum hyperprotéïné: SVF, SAB (= 1 à 2 gouttes en général) :
– facilite la sédimentation cellulaire
– favorise la conservation
– cytoprotection
– limitation perte cellulaire
Technique en 2 étapes (si volume > 2 mL) :
– Cytocentrifugation douce (1000 tr/min durant 5 à 10 min à +4°C)
– Surnageant éliminé et culot (visible ou non) entièrement repris par du
sérum hyperprotéiné (1 goutte)
– Si bonne maîtrise : récupération cellulaire de 10 à 40%
– Mais pas application stricte du CNS risk classification
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Travail collaboratif
Travail collaboratif : Dr O. Fenneteau (AP-HP/RDB) / Dr S. Girard (HCL/CBAPSCHLS)
But : Homogénéïser les modes opératoires d’étude cytologique du LCR
Etablir à terme des recommandations de réalisation de cette analyse
1ère étape 2011 : Réalisation d’une enquête / mailing des CHUs Français
– 25 centres sollicités (24 concernés)
– Items à renseigner : délai d’acheminement, étape(s) de la technique, matériel utilisé,
volume de LCR étudié, caractéristique de la cytocentrifugation (vitesse/temps), ajout ou
non de sérum hyperprotéiné
1ère synthèse réalisée en mai 2011 et présentée au congrès GFHC Mai 2011 – Marseille
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Conclusion de l’état des lieux
Grande variabilité
Pas de reproductibilité
Protocole de traitement des LA pédiatriques :
– Application de la classification du risque méningé
– Exploitation des données
– Pas de comparabilité des résultats stricto sensu
Futur protocole commun de traitement des LAL de l’enfant (FRALLE – EORTC)
=
Homogénéisation / Harmonisation des méthodes d’analyse
Comparabilité possible
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2ème étape : adopter un mode opératoire technique
4 points majeurs technique relevés :
→ Délai acheminement (prélèvement – prise en charge technique)
→ Ajout de sérum hyperprotéïné
→ Durée de cytocentrifugation
→ Vitesse de cytocentrifugation
Tests entrepris :
→ CHU de LYON (+/- sérum)
→ APHP (durée et vitesse centrifugation)
But = A l’issue des tests, rédaction de recommandations sous l’égide du
Groupe Francophone des hématologistes cellulaires (GFHC).
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1er point : +/- sérum
(préliminaire étude monocentrique)
Service d’Hématologie Biologique - Hôpital Edouard Herriot
Institut d’Hématologie et d’Oncologie Pédiatrique (IHOP)
Octobre 2010 – Avril 2011
Population :
26 patients pédiatriques (28 LCR)
16 garçons / 10 filles
âge médian : 4 ans (1-19 ans)
LAL, LAM, Lymphome lymphoblastique, Burkitt, ALCL : diagnostic et suivi
Protocole d’analyse :
GB 0-30/µL : 10 gouttes LCR pur (approx. 180 µL)
+/- 2 gouttes SVF (36 µL)
GB 30-200/µL : 7 gouttes LCR pur (approx. 125 µL)
Cytocentrifugation
6 min
600 tr/min
GB 200-600/µL : 3 gouttes LCR pur (approx. 55 µL)
GB > 600/µL : 2 gouttes LCR pur (approx. 35 µL)
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LCR :
Etalement
Volume
Nombre de Nombre de Statut au
reçu
diagnosis
gouttes
GB
Patient
(mL) GR GB
(18 µL)
- SVF
-SVF
22
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
15
16
17
19
20
22
23
24
25
26
27
28
18
1
1
1
1,2
1
1
1
1
1
1
1
1,3
1,1
1,8
1
1,5
1,2
1,2
1
1
1,5
1
1
2
1,5
1
2
0,8
5
23360
3
<2
2
<2
3
142
192
6
<2
<2
975
<2
75
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
2
8
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
7
3
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
3
10
10
0
28
1
2 (0 Blaste)
0
0
66
16
5
0
2
0
14
0
0
0
0
0
3
5
6
0
2
0
0
62
0
14
CNS-1
TLPCNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
TLPTLPCNS-1
CNS-1
CNS-1
TLPCNS-1
TLPCNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
Etalement
Nombre de GB Statut au
diagnosis
+ SVF
(2 gouttes)
+SVF
4
46
8
55 (15 Blastes)
8
12
264
85
51
2
23
53
69
2
19
1
8
7
14
47
12
1
2
3
30
109
1
2
Toujours des GB sur l’étalement (0/66 (-SVF) vs 1/264 (+ SVF))
+SVF : 4,1 fois plus de GB / 3,2 fois plus de PN / 3,7 fois plus de lymphocytes /
S. GIRARD - 21.06.2012
5,8 fois plus monocytes
CNS-1
TLPCNS-1
CNS-2
CNS-1
CNS-1
CNS-1
TLPTLPCNS-1
CNS-1
CNS-1
TLPCNS-1
TLPCNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNS-1
CNSCNS-1
CNSCNS-2
CNSCNS-3
TLP+
TLPTLP-
Nbre de patients
Mahmoud et al., NEJM 1993
Study XI SJCH
83
12
5
/
/
351
De Moerloose at al., Blood 2010
EORTC-CLG Study 58951
88,6
9,4
2
/
/
411
61,2
25,5 vs 45
en CMF
3,6
9,7
/
165
72,6
13,4
3,9
10
/
358
66,5
18,1
5,3
10,1
/
188
58,7
31,6
2,8
6,9
/
247
72,1
20,5
1,8
5,6
/
498
Pui, Blood 1998
Study XIIIA SJCH
Pui et al., leukemia 2010
Study 11 SJCH
Study 12 SJCH
Study 13B SJCH
PUI et al., NEJM 2009
Study 15 SJCH
India - Advani et al., Ann Oncol 1999
Sirvent et al., Eur J Cancer 2011
EORTC-CLG Study 58881
Bürger et al., JCO 2003
(ALL-BFM 1995)
te Loo et al., JCO 2006
(ALL-7, ALL-8)
CHU LYON - HEH/CBAPS
EORTC 58951 - 58081 (2008-2011)
1,3
92,1
2,5
2,4
3
/
2025
79,8
6080%
58
5,1
2,9
6,7
5,5
2012
5-20%
21
2-3%
2
10%
12
6%
7
304
57,6
18,6
1,7
9,3
12,7
118
0,8
700
5,7
174
India - Marwaha et al., Leuk Lymph
2010
UKALL X modifié
Zwaan et al., 2004 Blood
AML 87, AML 94 et AML 97
: Bromberg
S. CMF
GIRARD
- 21.06.012
et al., Neurol. 2007
4,14
52,3
21,3
7,5
13,2
73 CMF versus 32 morpho
1054
Depuis Mai 2011 : poursuite des tests analytiques
Ajout de sérum hyperprotéïné : essais complémentaires sur 34 LCR
Utilisation de SVF ou SA :
→ Pas de différence significative
Durée de cytocentrifugation : essais 8 min vs 12 min
Vitesse de cytocentrifugation : essais 600 vs 800 tr/min
Délai acheminement
maximum
S. GIRARD - 21.06.2012
: selon les données de la littérature = 2H
Conclusions
Cytologie = gold standard
(Glantz M.J. et al., Cancer 1998, Ranchere D. et al., Ann pathol 1999, Pui CH. et al., Semin Oncol
2009 , Chamberlain M.C.et al., YSONC 2010)
Sensibilité 50-60% - specificité env. 95% (Chamberlain M.C. et al., Semin Oncol 2009)
Faux négatifs : (Glantz M.J. et al., Cancer 1998)
délai d’acheminement au laboratoire trop long / volume trop faible
réduction des faux négatifs de 32% à 10% puis 3% en augmentant le volume analysé de 3,5 à 7 puis
10,5 mL !! Mais difficilement envisageable
Faux positifs : personnels inexpérimentés
Analyse délicate : paucicelllularité
AVENIR :
Harmoniser les modes opératoires de l’hexagone
Compte cellulaire sur automate ?
Apport de la CMF ?
(pas application de la classification du risque méningé)
Méthode complémentaire de la morphologie : sensibilité (73 à 96 %), spécificité (jusqu’à 97%),
rapide et confirmation de l’atteinte : VPP (88 à 96%) et VPN (76 à 97%)
Remerciements
APHP - Robert DEBRE
Service d’Hématologie Biologique
Dr Odile Fenneteau
CHU de Lyon - HEH
Service d’Hématologie Biologique
Mme Danielle Treille-Ritouet
CHU de Lyon – CBAPS/CHLS
Laboratoire d’Hématologie
Dr Pascale Felman
S. GIRARD - 21.06.2012
Institut d’Hématologie Oncologie Pédiatrique de
LYON (IHOP)
Pr Yves Bertrand
CHRU de Montpellier
Hôpital A. de Villeneuve
Service d’Onco-Hématologie Pédiatrique
Dr Nicolas Sirvent