Germination des Semences 2009 - IJPB

A
Al
R
Germination des Semences
E
Philippe Grappin
T
[email protected]
Embryophytes
(150 ma, crétacé)
Pteridospermaphyte
Pteridophyte Rhynia (300 ma)
Coleochaete (540 ma)
(adapté de J. Broutin, 2000)
Fécondation et formation de la graine
Dessin C. Dumas (2000)
T
A
E
R
T
Origine des diverses structures constitutives des semences d’après D. Côme (1982).
Analyse de la qualité physiologique de la semence
UMR INRA INA P-G Biologie des Semences, INRA de Versailles
maturation Dormance
dessication
Levée de Dormance
hydratation
embryogenèse
D
ND
hydratation
stockage à sec (after-ripening)
Vieillissement
Germination
Fertilization
Growth
Acquisition of
germination capability
Germination
Late M.
MATURATION
E.E.M.
Flowering
Spermaphyte life cycle
La germination est peut se produire dès que la graine est formé sur la plante mère
Exemple de la Mangrove
Fertilization
Growth
Acquisition of
germination capability
Germination
Late M.
MATURATION
E.E.M.
Flowering
Spermaphyte life cycle
Fertilization
MATURATION
E.E.M.
Flowering
Dormancy oneset
Late M.
Growth
Acquisition of
germination capability
Germination
Desiccation
Dispersal
orthodox seeds
Fertilization
MATURATION
E.E.M.
Flowering
Dormancy oneset
Late M.
Growth
Acquisition of
germination capability
Germination
H 20
Light
T°
02
Desiccation
(storage)
Dispersal
Dormancy release
Aging
Secondary dormancy oneset
time
time
World’s record for seed longevity - 1300 year old
sacred lotus
lotus fruits germinate.
A high protein repair activity indentified in viable ancient seeds
Shen Miller et al, 1995
B
C
R
T
A
•  Germination,
le premier acte de la vie végétale
(M. Georges Ville, 1868 Muséum d’histoire Naturelle)
débute par l’entrée d’eau dans la graine qui initie une
reprise de l’activité métabolique et se termine lorsque l’axe
embryonaire commence son élongation.
(Evanary et al. 1957)
Accomplissement de la germination chez
Nicotiana tabacum
Leubner-Metzger
et al., 1995
enbryon
albumen
téguments
Leubner-Metzger, 2000
La germination
H2 O
T°
Émergence
radiculaire
O2
Activité mitotique
Prise d’eau (% poids frais)
80
Début de l’élongation de l’axe embryonnaire
Mobilisation des
reserves
Accumulation de solutés
60
Reprise de la synthèse protéique
40
Reprise de la transcrition
ABA
20
Reprise de la respiration
Phase 1
Activation du
métabolisme
GA
expression / levée
de la dormance
Phase 2
Preparation de l’élongation
cellulaire
Post-germination et
Germination
croissance de la plantule
Potentiel en eau
•  Ψcell = Ψπ + Ψc + Ψp
–  Phase I : entrée d’eau selon |Ψc|
–  Phase II : entrée d’eau selon |Ψπ| et balance avec
–  Phase III :
|Ψπ|
|Ψp|
|Ψp|
Synthèse d’ADN durant la germination des graines de tomate (d’après de Castro et al., 2000).
Les noyaux marqués à l’iodure de propidium fluorescent en rouge et les noyaux marqués au FITC
fluorescent en vert, indiquant une incorporation de bromodeoxyuridine (3 h de pulse-labeling en
plus du temps d’imbibition annoncé) dans l’ADN en réplication active (phase S). a, pointe de la
radicule de graines sèches. b, pointe de la radicule à 12 h d’imbibition. c, pointe de la radicule à 24
h d’imbibition. d, pointe de la radicule ; e, méristème apical et f, cotylédons de graines germées
(48h après le début de l’imbibition). La barre indique 100 µm.
Métabolisme
énergétique
et
contrôle de la
germination
Dormance et contrôle métabolique
Dormance
Modèle proposé par Côme et Corbineau (1989) :
l’inhibition spécifique de la glycolyse par oxydation des enzymes de cette voie et la stimulation
de la voie des pentose phosphates favorisent la germination sensu stricto.
Ce contrôle métabolique permettrait d’augmenter la production de NADPH, cofacteur nécessaire au bon fonctionnement des
enzymes NADPH-dépendantes telles que les enzymes du système thiorédoxine réductase/ thioredoxines qui joue un rôle très
important dans l’activation de certaine enzymes nécessaire a la germination par réduction/oxydation de ponts disulfures.
Rôle de la thiorédoxine
dans la germination du blé
(Besse et al., 1996).
Métabolisme des ARN et germination
Niveaux d’ARN polyadénylés des embryons de blé en germinations (Rushton et Bray, 1987).
Contrôle
de
la germination
Analyses Physiologiques
Dormance
Incapacité germinative dans des conditions sub-optimales de germination
13°C + fluridone 10 µM
13°C
27°C + fluridone 10 µM
27°C
% Germination
Cvi, a proper model for comparative proteomics in Arabidopsis
7m
100
80
60
After-ripening
40
control
20
Dormancy release
0
% Germination
0
5
10
100
80
15
20
4j
25
Imbibed dormant seeds
60
environment
Stratification
40
1j
control
0
0
5
10
Seed sensitivity
to germination
2j
20
% Germination
http://www.mpiz-koeln.mpg.de
30
15
25µM30
10
20
100
-
NO 2
80
-
NO 3 7 mM
60
GA3
100 µM
40
control
20
0
0
5
10
15
20
25
30
http://www.mpiz-koeln.mpg.de
Imbibed non dormant seeds
Days after sowing
Ali-Rachedi et al, 2004
Changes in endogenous ABA level during imbibition
in A. thaliana Cvi seeds
Freshly harversted (D)
ABA pmol/g dry seeds
6 months after-ripened (ND) seeds
500
400
WTD
300
200
WT ND
After ripening
100
stratification
WTD+flu
0
0
1
2
3
4
6
21
Days after sowing
The Arabidopsis cytochrome P450 CYP707A
encodes
Ali Rachedi et al. 2004
ABA 8’-hydroxylases: key enzymes in ABA
catabolism.
Kushiro et al, (2004) Embo J 23 1647-1656
• 
This catabolism seemed more important in ND than in D seeds.
• 
In both species, dormancy was actively controlled in imbibed seeds by ABA
production.
• 
In both species, most of the treatments efficient in dormancy breaking
supressed this synthesis.
• 
Imbibition of D seeds, through ABA metabolism, is clearly a pivotal point of
seed dormancy control.
« what happens during dormancy maintenance in term of gene expression?
what are the regulated genes in response to ABA? »
Un contrôle hormonale de la résistance des enveloppes de
l’embryon à la percée radiculaire
Figure 1-8 : Forces requises pour traverser l’albumen de graine de
tomates sauvages imbibées sur eau (●) ou sur 1O µM d’ABA (○) et
de graine gib1 imbibées sur eau (■) (Toorop et al., 2000). Aucune des
graines mesurées n’a accomplie la germination, la flèche indique les
premières graines sauvages sur eau ayant germé.
Fig 1-9 : Empreintes de graines de tomates en germination
(24h d’imbibition) et germées, hybridées avec une sonde
ribonucléique LeMAN2 (Nonogaki et al., 2000).
Contrôle hormonal de la germination chez N.
tabacum
Leubner, 2000
Le rôle des GAs dans la germination
Structure de GA1 et résumé des
réponses aux gibbérellines
(d’après Hooley, 1994,; Davies, 1995)).
CROISSANCE CELLULAIRE
DEVELPPEMENT DE LA
FLEUR ET DU FRUIT
- élongation des tissus de la
tige
- forme de la feuille et
croissance des
pétales
- croissance du tube pollinique
- germination de la graine
-initiation florale
- développement de
l’anthère
- pigmentation de la
corolle
- développement du fruit
MOBILISATION DES RESERVES
PAR LES CELLULES A
ALEURONES
- synthèse et sécrétion de diverses
hydrolases
- forme de la feuille et croissance des
pétales
- libération de myo-inositol, de
phosphore et d’ions minéraux
Réponse aux GAs est modulée par
concentration en GA dans les cellules / aptitude de la cellules à répondre aux GAs
Richards et al. 2001
Un transcriptome régulé par les GAs
ga1-3
Germination kinetic
Ogawa et al. Plant Cell 2003
Régulation de la synthèse des GA dans la graine
par la lumière
Yamaguchi et al., Plant Cell, 1998
Les 2 gènes GA4 et GA4H d’Arabidopsis codent pour une GA3Bhydroxylase qui catalyse l’étape final de la biosynthèse de GA actives
Sequence Alignment of GA 3b-Hydroxylases.
In Vitro Functional Analysis of the Recombinant GA4H Protein.
(A) Diagram showing conversion of GA9 and GA20 to GA4 and GA1 by 3b-hydroxylation.
(B) Functional analysis of the GA4H protein. Lysates of E. coli containing the MBP (as a
control) or MBP–GA4H were incubated with 14C-GA9. The reaction mixture was separated on
a silica gel by thinlayer chromatography. The positions of authentic GA4 and GA9 are
indicated by arrowheads.
Yamaguchi et al. Plant Cell, 1998,
GA4 est accumulé dans les siliques et en début d’imbibition
L’expression de GA4H est spécifique de la graine en germination
- GA4 et GA4H sont induits par une
irradiation rouge claire d’1 heure dans la
graine imbibée.
- L’accumulation de l’ARN GA4H est
maintenu jusqu’à la germination.
GA4 et GA4H sont réprimés par le rouge lointain
En context phyB-1 GA4H n’est pas induit par le rouge claire
Modèle simplifié de la germination
des graines de tabac
D’après Leubner-Metzger et Meinz (1999)
La rupture des tégument et de l’albumen sont des évènements séparés
chez Nicotiana tabacum.
Identification de gènes
impliqués dans la germination
L’approche de génétique directe a vite montré ses limites
pour caractériser de nouveaux gènes impliqués dans le
contrôle de la germination
Toujours les mêmes mutants isolés
(GA, ABA déficients /insensibles)
Approche QTL met en évidence un
déterminisme génétique complexe
(M. Koornneef)
Sélection sur le
critère d’une
ségrégation
anormale de la
résistance à la
kanamycine
T2
Ks 1/3
Kr
2/3
Non germées 1/3
Exemple de crible génétique sur la collection de
mutants d’insertion d’Arabidopsis de l’INRA de
B. Dubreucq
Versailles
Dubreucq et al., 1996
Approche globale pour caractériser de nouvelles fonctions
impliquées dans le contrôle de la germination
Caracterisation
physiologique et
biochimique
Génomique
fonctionnelle
Génétique
inverse
Hypothèse de travail
gènes candidats
Analyse spatio-temporel
de
l’activité génique
(a) Germinated Arabidopsis seed
under a dissection microscope.
(b) Scanning electron
microscopy of germinated
Arabidopsis seeds.
(c) Close up view of the surface
cells of the radicle.
(d) Close up view of the surface
cells of the endosperm.
(e) Scanning microscopy of
germinated seed immediately
after radicle emergence.
Scale bars ¼ 100 lmfor (a), (b)
and (e); 10 lmfor (c) and (d).
Arabidopsis seed structure following germination.
P-P Liu et al. Plant J, 2005, 41, 936–944
Germination time course of wild-type Arabidopsis (Columbia-0) seeds. Completion of germination, which
was defined as penetration of radicle through the endosperm layer (endosperm rupture; closed symbol),
was recorded together with the occurrence of testa rupture (open symbol). Imbibition time indicates time
of incubation at 22C. Each data point represents the average of three replicates; vertical bars indicate
SD.
Variable tissue-specific GUS
expression in germinating and
germinated seeds of the enhancertrap Arabidopsis lines.
(a–c) GUS expression in the whole
seed (except for testa), the embryo
and the endosperm in the same
seeds, respectively.
(d–g) GUS expression in the whole
axis, hypocotyl, hypocotyl plus
cotyledons and cotyledon tips
(arrows) in germinating seeds,
respectively.
(h) GUS expression in whole radicle
of germinated seed.
Scale bars ¼ 10 lm.
P-P Liu et al. Plant J, 2005, 41, 936–944
(a–c) Embryo-specific GUS expression.
(d–g) Endosperm-specific GUS expression.
GUS activity is detected only in the
micropylar half of the endosperm (with
testa; d), but not in the lateral half
of the endosperm (e), radicle (f) and
hypocotyls plus cotyledons (g).
(h) GUS and tetrazolium (TZ) staining of
‘scratched’ seeds. Part of testa was
removed before staining to enhance the
penetration of the substrate
Scale bars ¼ 10 lm.
Micropylar region-localized GUS expression in germinating Arabidopsis seeds.
Summary of tissue-specific GUS expression patterns in germinating
and germinated seeds of the Arabidopsis enhancer-trap lines.
Identification of the T-DNA insertion site in the TMH1 enhancertrap line.
(b) PCR product amplified with the GSP and TSP from wild type (WT) and the enhancer-trap line (TMH1) genomic DNA.
(c) PCR products amplified using At5g02750 and At5g02760 gene-specific primers with wild-type Arabidopsis genomic
DNA (gDNA) and reverse transcription products (RT) of total RNA extracted from germinated (36 h) wild-type seeds.
The T-DNA insertion sites identified
in the enhancer-trap lines and their
GUS expression patterns. The
genomic DNA region (10 kb) in the
vicinity of the T-DNA insertion sites
(arrows) containing the candidate
trapped genes is shown in the table.
Analyse du transcriptome
de
la graine au cours de la germination
- A control of gene expression and of protein accumulation related to
physiological changes (dormancy release, aging) occurs in dry seeds
Cluster
IV IV
Cluster
Cluster V
(209 protéines)
(137 protéines)
3 months
6 onths
9 months
2D electrophoresis
12 months
Separation
proteins
K. Chibani
D
3
6
9
12
D
3
9
6
12
A. thaliana
After-ripening
aging
ga1V0 / ga1V2
ARNm
J. Bove
zea4V0 vs zea4V2
100000
zea4V0 / zea4V2
ga1V2
Hybridation
zea4V2
zea4V2
10000
cDNA-arrays
1000
100
10
10
V0
V2
ga1V0
100
1000
10000
100000
zea4V0
zea4V0
N. plumbaginifolia
Identification de gènes impliqués dans la dormance des
graines de Nicotiana plumbaginifolia
D
ND
D
ND D ND
D ND
S 8 16 24 S 8 16 24 S 8 16 24 S 8 16 24 S 8 16 24 S 8 16 24 S 8 16 24 S 8 16 24
Fragments d’ADNc détectés
15 000
Induits chez les graines D
544
Induits chez les graines ND
476
Clonés et séquencés
412
Similaires à des séquences
des bases TrEMBL et SwissProt ([E]<10-4)
137
Fonctions assignées
85
Transcriptomic analysis of dormancy maintenance and release
in N. plumbaginifolia using cDNA-AFLP
Detected cDNA fragments
15 000
Induced in D seeds
544
Induced in ND seeds
476
Resistance, protection against aging
Transports
Dormant
Non dormant
(%)
(%)
4,8
0
4,8
0
Metabolism 11,9
4,8
Signaling
7,1
Transcription
7,1
Proteolysis
7,1
6
8,3
13,1
Protein synthesis
1,2
Vesicular trafficking
1,2
14,3
8,3
Dormancy release is related to up–regulation of protein biosynthesis genes at the
RNA level
Bove et al, 2005
De Diego et al, 2006
Collaboration E Cerventes (CSIC, Salamanca)
Conclusion 2
- La traduction est indispensable à la germination (Rajjou et al., 2004)
- ABA régule les gènes de contrôle de la traduction (Hoth et al., 2002)
L’ABA maintient la dormance des graine via une répression au niveau
ARN de l’activité de biosynthèse des protéines.
Protein biosynthesis in germinated seed
- Protein translation is required in imbibed
seeds for germination (Rajjou et al, 2004)
α-amanitine
H 2O
cycloheximide
- RNA encoding translation factors are up-accumulated during dormancy
release (Bove et al, 2005; Cadman et al, 2006)
D dry
pI
MM
(kDa)
89.3
4
.
5
4
.
9
5
.
2
5
.
3
5
.
6
5
.
8
5 6
.
9
6 7
. .
3 2
8
.
3
9
.
1
ND dry
5.8
9
5.8
9
79.3
68.7
Up accumulation of
46.6
translation proteins in ND
seeds ?
46
57.7
35.8
45
80.76
80.
76
46
45
EF-2 elongation factor
29.3
25.2
17.6
14.0
Chibani et al, 2006
Control of protein synthesis and dormancy release
20000
cpm/µg de protEins
[35S]-Met incorporation
Protein de novo synthesis activity is similar in D and ND hydrated seeds
15000
10000
5000
0
D 1d
Control
ND 1d
After-ripening reprograms the pattern of protein synthesis upon imbibition
Mm
(kDa)
ND 1 day
D 1 day
pI
4.5 4.9 5.3
89.3
89.3
79.3
272
68.7
57.7
6
NI
46.6
35.8
6
659
NI
NI
4.5 4.9
7.2 9.1
C
89.3
79.3
5.3
6
7.2 9.1
B
272
68.7
57.7
30
30
31
692
31
46.6
35.8
29.3
29.3
25.2
25.2
NI
145 111
480
17.6
17.6
14.0
14.0
117
Autoradiography (35S-Met)
213
ND seeds translate specific
set of genes required for
germination
901
Chibani et al, 2006
Collaboration D Job (CNRS, Lyon)
Contrôle des GA sur le transcriptome de la graine
ga1-3
wt
Ogawa et al. Plant Cell 2003
Ogawa et al. Plant Cell 2003
Un transcriptome régulé par les GAs
ga1-3
Germination kinetic
Ogawa et al. Plant Cell 2003
GA4
GA4
(A) GA up-regulated genes
(B) GA down-regulated genes
GA4
GA4
Cellular distribution of GA biosynthesis and response
Cellular Localization of GA-Regulated Transcripts
(A) 
(B) 
(C) 
(D) 
(E) 
Expression profiles of GA-upregulated genes used for in situ
hybridization experiments.
Scheme of an Arabidopsis mature embryo. CO, cotyledon;
HY, hypocotyl; RA, radicle; SA, shoot apical meristem.
In situ hybridization analysis of the GA biosynthesis gene
AtGA3ox1 in wild-type seeds imbibed for 24 h.
In situ hybridization analysis of GA-upregulated genes :AtXTH5 (At5g13870), AtCP1 (At4g36880), and PDF1
(At2g42840).
Magnified views highlighting AtCP1 transcript accumulation
in the aleurone and the epidermis after GA4 treatment.
GA-Regulated Cellular and Metabolic Pathways during Seed Germination.
(A) Genes implicated in cell elongation (top) and cell division (bottom).
(B) GA biosynthesis genes. Gene identities are described in the legend to Figure 2.
(C) Ethylene biosynthesis and response genes. ACO (At2g19590), ERS1 (At2g40940), and HLS1 (At4g37580).
(D) Genes implicated in auxin transport. AUX1 (At2g38120), PIN2/EIR1 (At5g57090), and PIN7 (At1g23080).
(E) Genes encoding (putative) transcription regulators whose expression was regulated by GA4 within 6 h. ATHB-16 (homeodomain-Leu zipper protein;
At4g40060), AtMYB34/ATR1 (At5g60890), Dof (Dof zinc finger protein; At2g28510), SCL3 (SCARECROW-LIKE3; At1g50420), AtMYB66/WER (At5g14750),
PIF4 (At2g43010), Zinc finger1 (At1g27730), and Zinc finger2 (At2g28200).
Contrôle de la réponse aux GAs
Représentation des mutants gai et
rga altérés dans la réponse aux
gibbérellines.
Rôle des protéines GAI/RGA/SLR
Silverstone AL et al. (2001)
Rôle de NpRGL2?
Hypothèse d’un régulateur positif de la réponse aux GA
NpRGA2, a positive regulator seed coat imposed
dormancy
Light
ABA
After-ripening
GA
Exogenous ABA
NpRGA2
micr.
rad.
end.
coty.
rad.
end.
Testa rupture
rad.
coty.
Endosperm
weakening
te.
coty.
te.
te.
micr.
rad.
ext. te.
int. te.
te.
te.
micr.
end.
end.
0.1 mm
0.1 mm
0.1 mm
Validation of the cDNA-AFLP approach
Godin et al. (in preparation)
ABI5, impliqué dans la perception de l’ABA,
réprime la germination en absence de GA
Relation perception ABA – RGL2
dans le contrôle de la
germination
Rôle de GPA1 dans le contrôle
hormonal de la germination
d’Arabidopsis
(Ullah et al., 2002).