MODE OPERATOIRE Tampons et autres solutions pour l

Version : 2
Date d'application :
08/04/2011
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Référence du document : MO_IMAG_01
CNRS-UPR 9021
MODE OPERATOIRE
Tampons et autres solutions pour l'imagerie
1.
OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION
Ce mode opératoire décrit la préparation des tampons et différentes solutions présentant une
préparation particulière utilisées dans les différentes expériences des procédures d’imagerie.
2.
MATERIEL / EQUIPEMENT
Marque
CONSORT digital pH
meter
N° d’inventaire
Salvis (40°C à 180°C)
ICT-BIOXX001
Balance
Ohaus
ICTXX003
Balance
Sartorius
ICTXX004
KNF
ICT-BIOXX002
Appareil
PH mètre
Bain marie
Pompe à vide
3.
ICTXX002
Pièce
Laboratoire
138
Laboratoire
137
Laboratoire
138
Laboratoire
138
Laboratoire
137
REACTIFS ET CONSOMMABLES
3.1.
Liste des réactifs et consommables
Dénomination
Na2HPO4.2H2O
NaH2PO4.2H2O
NaCl
KCl
Tris-HCl
acétate de sodium
Paraformaldéhyde granulés
Lieu de stockage
Laboratoire 138
poudres chimiques
Laboratoire 138
poudres chimiques
Laboratoire 138
poudres chimiques
Laboratoire 138
poudres chimiques
Armoire Laboratoire
137 (µscopie)
Laboratoire 138
poudres chimiques
Armoire Laboratoire
137(µscopie)
Fournisseur
Réf.
Fournisseur
Caractéristique
Euromedex
1309
M.W. 178 g/mol
Euromedex
T879
M.W. 156.01 g/mol
SIGMA
31434
M.W. 58.44 g/mol
SIGMA
31248
M.W. 74.55 g/mol
SIGMA
T3253-500g
M.W. 157.59 g/mol
MERCK
6268.1000
M.W. 82.03 g/mol
Delta
Microscopies
19208
M.W. 600 g/mol
SIGNATAIRES
Rédacteur
Date et Signature
Vérificateur
Date et Signature
Approbateur
Date et Signature
Application par
Service Qualité
Support :
Date :
Mode opératoire(MO)_modèle_v5 du 13/11/09
Référence de la procédure : PT_
CNRS-UPR 9021
Référence du document : MO_IMAG_01
citrate de sodium
(C6H5O7Na3, 2H2O)
Laboratoire 138
poudres chimiques
Laboratoire 138
Acide citrique (C6H8O7, H2O)
poudres chimiques
Laboratoire 138
EDTA 108
poudres chimiques
Laboratoire 138
Glycine
poudres chimiques
Laboratoire
Papier whattman
137(µscopie)
3.2.
Version : 2
Date d'application :
XX/XX/XX
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MERCK
6448
M.W. 294.10 g/mol
Riedel
deHaen
33114
M.W. 210.14 g/mol
Sigma
E5134
M.W. 372.34 g/mol
SIGMA
G8898-1Kg
M.W. 75.07 g/mol
VWR
512-1006
Préparation des réactifs
/
4.
MODE OPERATOIRE
4.1.
-
Tampon phosphate (PB) 0,2M
Solution A : 0,2 M de Na2HPO4.2H2O (35,6 g/l).
Solution B : 0,2 M de NaH2PO4.2H2O (31,2g/l).
PB 0,2 M solutions A et B dans des ratios 4 pour 1 respectivement.
Ajuster le pH entre 7,2 et 7,6. Avec la solution A (basique) ou la solution B (acide)
Remarque :
A 4°C, le PB 0,2M peut cristalliser, le ramener à température ambiante avant utilisation.
4.2.
-
50 ml de PB 0,2M.
8,76 g de NaCl.
0,2 g de KCl.
compléter à 1 litre avec de l’eau milliQ.
Ajuster le pH entre 7,2 et 7,6.
4.3.
-
Tampon Tris Salin (TBS) 1X
Tris-HCl 0,05M (7,88g).
NaCl 0,15M (8,76g).
Compléter à 1 litre avec de l’eau milliQ.
Ajuster le pH à 7,4.
Filtrer sous pompe à vide à 0.22µm : utiliser la pompe des chimistes pour utiliser
l’unité de filtration en verre avec filtres jetables (tiroir labo microscopie)
4.4.
-
Tampon phosphate Salin (PBS)
Tampon Tris Salin (TBS) 20X
Tris-HCl 1M (157.6g).
NaCl 3M (175.2g).
Compléter à 1 litre avec de l’eau milliQ.
Ajuster le pH à 7,4.
Mode opératoire(MO)_modèle_v5 du 13/11/09
Référence de la procédure : PT_
CNRS-UPR 9021
-
Filtrer sous pompe à vide à 0.22µm : utiliser la pompe des chimistes pour utiliser
l’unité de filtration en verre avec filtres jetables (tiroir labo microscopie)
4.5.
-
Référence du document : MO_IMAG_01
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XX/XX/XX
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Acétate de sodium 0,1M pH 7
13,6 g d’acétate de sodium.
1l d’eau milliQ.
Ajuster le pH à 7 avec de l’acide acétique (diluer l’acide 100%).
4.6.
Formaldéhyde (PFA) 10% pH 7,4 (pour un Falcon de 50ml) (note : on parle
de paraformaldéhyde en poudre et de formaldéhyde en solution)
Ne pas stocker plus de 1mois à 4°C et quelques mois à -20°C
-
Peser 5g de paraformaldéhyde.
Compléter le Falcon à 50ml avec du PB 0,1M.
Faire chauffer au bain marie à 50°C en agitant régulièrement jusqu’à dissolution
complète.
Filtrer sur papier.
Stocker à 4°C pour un mois maximum ou à -20°C pour quelques mois.
Diluer extemporanément à la concentration voulue avec du PB 0,1M.
Remarques :
 Le paraformaldéhyde peut être dissout plus rapidement en ajoutant quelques gouttes de
NaOH 10N, le pH devra ensuite être ramené entre 7,2 et 7,6.
 A manipuler sous la hotte avec des gants.
4.7.
Formaldéhyde (PFA) 10% pH 7,4 (pour 9 Falcons de 50ml – remplir le portoir
stock du -20°C)
Ne pas stocker plus de 1mois à 4°C et quelques mois à -20°C
-
Peser 45g de paraformaldéhyde.
Compléter à 450ml avec du PB 0,1M, mettre dans une bouteille fermée.
Faire chauffer au bain marie à 50°C en agitant régulièrement jusqu’à dissolution
complète.
Filtrer sur papier et remplir 9 falcons avec cette solutuion.
Stocker à 4°C pour un mois maximum ou à -20°C pour quelques mois.
Diluer extemporanément à la concentration voulue avec du PB 0,1M.
4.8.
Les tampons de démasquage antigéniques pour coupe paraffine
4.8.1. Tampon citrate 10mM pH6 (démasquage antigénique pour coupes
paraffines)
-
Solution A : acide citrique (C6H8O7, H2O) 0.1M (2.1g/100ml H2O).
Solution B : citrate de sodium (C6H5O7Na3, 2H2O) 0.1M (2.94g/100ml H2O).
Mélanger 9ml de solution A à 41ml de solution B.
Compléter à 500ml avec de l’eau distillée.
Filtrer sous pompe à vide à 0.22µm
Mode opératoire(MO)_modèle_v5 du 13/11/09
Référence de la procédure : PT_
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4.8.2. Tampon Tris-HCl 100 mM, pH 10
-
Tris-HCl 15.7 g.
Eau distillée ~ 800 ml.
Ajuster le pH à 10 avec de l'HCl.
Eau distillée q.s.p. : 1 litre.
4.8.3. EDTA 10 mM, pH 8.0
EDTA 108 (SIGMA ref : E5134, PM 372.24 g/mol se dissous mieux) peser 3,72g/L ou EDTA
(SIGMA ref : E6758 ; PM : 292.24 g/mol) peser 2.92g/L
- Eau distillée ~ 800 ml.
- pH ajusté à 8.0 avec de la soude.
- Eau distillée q.s.p. 1 litre.
4.8.4. Tampon glycine-HCl 0,05M, pH 3,6
-
5.
Glycine 3,75 g.
Eau distillée ~ 800 ml.
Ajuster le pH avec de l'HCl.
Eau distillée q.s.p. 1 litre.
NETTOYAGE ET TRAITEMENT DES DECHETS
 Evacuer les solutions de fixateurs chimiques et les solvants dans les containers en
plastique situés sous la hotte qui sont évacués selon les procédures de l’UdS.
6.
SECURITE
 Manipuler le formaldéhyde sous la hotte.
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