Bandes GTG

Différents types de chromosomes en Giemsa
Marquage Giemsa simple
- Comptage d’une mitose: 45, 46 ou 47
- Reconnaissance des groupes et certains
chromosomes dans les groupes, mais pas
dans leur structure, ce qui permettrait
d’évoquer d’éventuels diagnostic selon
l’indication
- Marque l’ADN satellite, sur les p des
acrocentriques
- Utilisé à aider pour distinguer un
polymorphisme des bras courts non codants
des chromosomes acrocentriques, d’une image
pathologique où les satellites n’apparaissent
pas
Caryotype
Marquages GTG et RHG
Etude de la structure du chromosome
• Bandes GTG: Bandes G Trypsine Giemsa, par digestion
enzymatique à la trypsine
• Bandes RHG: Bandes R (Reverse) Heat Giemsa, par
dénaturation par la chaleur (solution de Earle à 87°C, PH à
5.3)
Les bandes GTG et RHG sont
- complémentaires
- utilisées en routine
- il est recommandé d’utiliser les 2 marquages
Les bandes RHG et GTG marquent les régions euchromatiques
codantes du chromosome
~ 50% pour les bandes GTG de réplication tardive
~ 50% pour les bandes RHG de réplication précoce
Bandes chromosomiques (GTG)
N° du chromosome
p: bras court
q: bras long
• Régions
• bandes
• sous-bandes (≤ 3)
• subdivisions de la sousbandes, si la résolution
est bonne
Bande12q21.3
Bande 13q31
Bande 12q24.32
Chromosomes en bandes (GTG)
Régions, bandes et sous-bandes
1 à 22: autosomes ou chromosomes non sexuels
X et Y: chromosomes sexuels
Caryotypes standards sans anomalie
23 paires de chromosomes, 23 hérités de la mère et 23 du père
Caryotypes diploïdes 2n
46,XY
Masculin
Bandes G (GTG)
46,XX
Féminin
Bandes R (RHG)
46,XX caryotype féminin - GTG
46,XY caryotype masculin - RHG
Complémentarité du marquage
des bandes RHG et GTG
Bandes G (GTG)
Bandes R (RHG)
Autres bandes
• Bandes plus spécifiques, mais non utilisées
en routine
- Bandes C: marquent l’hétérochromatine
constitutionnelle non codante
- Bandes NOR marquent les nucleolar
organizers ou ADN ribosomal (ADNr), sur
les bras courts des chromosomes
acrocentriques
Bandes C
Marquent l’hétérochromatine
constitutionnelle non codante
- Centromères (constrictions primaires)
- Constrictions secondaires des chromosomes
1, 9 et 16, plus ou moins longues =>
polymorphisme
- Bras courts des grands et petits acrocentriques
- la région hétérochromatique du chromosome
Y
Cytogénétique moléculaire
Résolution supérieure
• FISH: quelques centaines de Kb
• CGH: ~ 5 Mb (délaissée)
• CGH array ou puces: 1 gène
Tout dépend du nombre de clones répartis
sur une lame
Limites du caryotype
La résolution (1 bande ~ 10 - 20 Mb)
- Sang: 400 à 550 bandes par lot haploïde
- LA: 300 à 400 bandes
- Villosités choriales: 300 bandes
FISH: Fluorescent In Situ Hybridization
(Hybridation in situ fluorescente)
Visualisation d’un chromosome ou d’une
portion de chromosome par des sondes
fluorescentes métaphasiques (sur mitoses),
ou interphasiques (sur noyaux)
1- de tout le chromosome: peintures
2- centromériques ou télomériques
3- sites spécifiques
Ces sondes sont commerciales, ou maison: BAC
(Bacterial artificial Chromosome)
L’ADN: une double hélice complémentaire
Structure de chaque brin
Sucre + phosphate + 1 base = nucléotide
maintenu par des liaisons hydrogène
3’
5’
5’
3’
2 brins d’ADN
complémentaires
et antiparallèles
5’- ATGCCAG - 3’
3’- TACGGTC - 5 ’
Appariement des bases
par des liaisons hydrogène
A
C
T
G
PRINCIPE DE LA FISH
Principe de FISH
Cellule interphasique
Culture cellulaire
Examen direct
Sonde marquée
Chromosome
métaphasique
Noyau,
en interphase
FISH interphasique sur LA
• Préculture surtout: seulement sur noyaux
pour le diagnostic prénatal:
- sondes du centromère de l’X, Y, 18
- sondes site spécifique sur le 13, 21
• Post culture parfois: sur mitoses et noyaux
Avantage: comptage de beaucoup de cellules (mitoses
et noyaux)
Limites: résultat partiel; ne décèle que des anomalies
de nombre et non de structure, qui correspondent
aux sondes utilisées
Trisomie 21 sur amniocytes - noyaux
2 signaux du 13
3 signaux du 21
TRISOMIE 18 SUR AMNIOCYTES
FISH centromériques X,Y et 18
18
Y
18
X
18
Sondes centromériques
Sondes du centromère utilisée pour
déceler des anomalies de nombre
d’un chromosome:
- En préculture pour les chromosomes 18, X et Y
- En post culture, pour tous les chromosomes en
cytogénétique prénatale, postnatale et oncohématologique, où la lecture se fera sur les
mitoses et noyaux
Peintures chromosomiques
• Il y a des peintures pour tous les chromosomes
• Si 2 peintures sont utilisées à la fois pour 2
chromosomes différents, utiliser 2 marquages
différents. Sont utilisées:
- pour reconnaître un marqueur ou chromosome
surnuméraire, en mosaïque ou homogène
- pour vérifier un remaniement
- pour vérifier une délétion pour un chromosome
- ne peuvent être effectuées qu’après culture, et
ne sont lues que sur mitoses
Sondes sites spécifiques
• Hybrident aux sites qui correspondent aux
syndromes micro-délétionnels
• 2 sondes sont associés, l’un servant de contrôle
pour l’autre
• Sont utilisées:
- pour reconnaître si un locus spécifique est
délété (sur mitoses et noyaux), ou dupliqué (sur
noyaux)
- sont mieux lues après cultures, sur mitoses et
noyaux
Peinture chromosomique
du chromosome 4
montrant une délétion partielle de
l’extrémité d’un bras court,
confirmée par une délétion 4p Wolf
Hirshhorn, sonde site spécifique
Pas de délétion 22q11.2
Sondes sites
spécifiques
2 sondes marquées
- locus du Di George
en 22q11.2
- sonde contrôle en
22q13
Sondes des télomères
• Sonde tous télomères (TTAGGG)n, non
spécifiques des télomères, hybrident
les extrémités de tous les chromosomes
• Sondes subtélomériques, spécifiques pour
chaque paire chromosomique. Toutes les
extrémités sont représentées sauf
celles des bras courts des 5 paires de
chromosomes acrocentriques
- Mêmes sondes Xp et Yp; pareil pour Xq et Yq
- Les bras courts des chromosomes acrocentriques n’étant
pas codants, ne sont pas représentés
PROTOCOLE MULTISONDE
STRUCTURE DU TÉLOMÈRE
Sonde tous télomères (TTAGGG)n
FISH subtélomérique spécifique pour les
extrémités des chromosomes, hors les bras
courts des acrocentriques (mitose)
17pter
17qter
FISH subtélomérique spécifique pour
chaque extrémité de chromosomes, hors le
bras court des acrocentriques (noyaux)
Chromosome Genomic Hybridization (CGH)
Cohybridation
d’un ADN à tester
+
d’un ADN témoin
marqués
par 2 fluochromes
différents sur des
métaphases normales
Visualisation d’un
déséquilibre par
compétition de
l’hybridation
Caryotype spectral
délaissé au profit de la CGH array
• Hybridation simultanée sur métaphases de 24
sondes de peinture spécifiques des 22 paires
d’autosomes et de chromosomes X et Y
• Chaque paire chromosomique possède une
couleur propre, ce qui permet leur classement et
ainsi la détection de remaniements
chromosomiques complexes, équilibrés ou non
sans besoin d’orientation préalable
Caryotype spectral par peinture de tous les chromosomes
Grâce à la combinaison de 5 fluorochromes dans des proportions variées de
visualiser une couleur spécifique artificielle pour chaque paire chromosomique.
Il est adapté à l’étude de remaniements chromosomiques complexes ou à
l’identification de certains marqueurs
Puces d’hybridation génomique
comparative (CGH array)
• Techniques sur l’ADN
• Décèlent les déséquilibres chromosomiques
avec grande précision
• Ne décèlent pas les remaniements équilibrés,
contrairement au caryotype
• Hybridations par compétition de l’ADN témoin et
ADN test
• Sont généralement faits en double: alternativement,
soit
- témoin/patient
- 3 patients dont, l’un sert de témoin aux 2 autres
• Vérification des déséquilibres par FISH et/ou PCR
Préparation des lames CGH Array ou puces
Principe de la CGH array
Marquage
des ADN
Analyse des
rapports de
fluorescence
Cy3/Cy5 par un
logiciel
adapté
ADN
ADN
patient témoin
*Cy5
*Cy3
Lavage
Puce 2500
clones (BAC)
Cohybridation
Lecture par
scanner
Préparation des lames pour puces
Pas de déséquilibre noté du
chromosome 1
Délétion interstitielle 10p
Vrai déséquilibre si image en miroir,
sinon artefact